Функциональные особенности нейтрофилов
Со времени П. Эрлиха принято объединять в группу гранулоцитов форменные элементы крови, имеющие выраженную зернистость в цитоплазме и однотипную эволюцию ядра. Однако в настоящее время такое объединение — скорее дань традиции, так как нейтрофилы, эозинофилы и базофилы имеютссобственных предшественников и каждый из 3 ростков высокоспецаализирован.
Нейтрофильные лейкоциты составляют большую часть (43—60% или 2,2—4,2xl09/л) всех ядросодержащих клеток периферической крови.
Средний диаметр нейтрофила 9—15 мкм; макрогенерации, наблюдаемые при сепсисе, цитостатическом воздействии и после облучения, достигают 20 мкм и более. Зрелый нейтрофил характеризуется умеренно компактным ядром палочковидной или полисегментированной формы; при полисегментации ядра обычно имеется 2—4 сегмента, соединенных перемычками ядерного вещества (см. рис. 68). В норме 95% нейтрофилов имеют индекс сегментации 2,44—3,49 на клетку [Кисляк Н. С., Ленская Р. В., 1978].
Цитоплазма, окрашиваемая в розоватый цвет, наполнена мелкой (пылевидной) зернистостью, слабо воспринимающей азур и эозин, т. е. нейтральной; иногда при окраске по Романовскому зернистость имеет голубоваторозовый цвет.
В 1—2% сегментоядерных нейтрофилов у женщин наблюдается дополнительный малый ядерный сегмент — тельце Барра или барабанная палочка (описан Davidson, Smith в 1954 г.), присутствие дополнительного сегмента обусловлено наличием второй Ххромосомы.
При интоксикации зернистость циооплазмы становится более крупной и базофильной — токсогенная зернистость. Солитарные голубоватые включения в цитоплазме, наблюдаемые в нейтрофилах при скарлатине, дифтерии, тяжелой пневмонии, получили название телец Князькова — Деле (сейчас они наблюдаются редко). При септических проеессах может возникать вакуолизация цитоплазмы нейтрофилов.
Наследственная аномалия нейтрофилов, внешне характеризующаяся асегментацией или бисегментацией ядер и уплотнением хроматина, описана впервые К. Пельгером (1928). В дальнейшем были выявлены цитохимические сдвиги в нейтрофилах при этой аномалии, а также описаны приобретенные формы асегментирования — так называемые пельгероиды. Гиперсегментация ядер нейтрофилов (до 10—12 сегментов) наблюдается при мегалобластных анемиях, сепсисе, после облучения. Пул гранулоцитов и моноцитов (макрофагов) возникает из относительно небольшого числа клеток-предшественниц III класса — колониеобразующих в агаре клеток. Около 38% таких клеток-предшественниц [Maloney, Pan et al., 1971] или около 15—20%, по данным Cronkite (1979), пролиферируют без дифференцировки — неэффективный гранулопоэз.
Среднее время дифференцировки от миелобласта до зрелого нейтрофила составляет 8—10 сут, при этом происходит от 4 до 11 митозов;
время дифференцировки от миелоцита до сегментированного нейтрофила in vitro и in vivo в норме составляет около 48—50 ч [Lajtha, 1959, 1963;
Fliedner et al., 1964], это время при стрессовых воздействиях может значительно укорачиваться. В обычных условиях зрелыеннейтрофилы задерживаются в синусах костного мозга до 3—5 сут, формируя костномозговой | ранулоцитарный резерв. Выход в кровоток связан с протеолизом оболочки, окружающей островок гранулопоэза; но при септических состояниях и агранулоцитозах костномозговой ретенции нейтрофилов нет.
Длительность циркуляции нейтрофила варьирует от 2 до 34 ч, она зависит и от гуморальных воздействий, и в какой-то мере от метода определения [Boggs, 1975]. В физиологических условиях нейтрофилы распределяются приблизительно равномерно между краевым (пристеночным, маргинальным) и циркулирующим пулом [Cronkite, 1979]. Мобилизация гранулоцитов из краевого пула происходит при волнении, мышечной нагрузке, после приема пищи, после введения глюкокортикостероидов, катехоламинов, этиохоланолона, эндотоксинов — перераспределительный лейкоцитоз. При сепсисе, агранулоцитозе краевой пул редуцируется за счет гибели клеток и миграции их в ткани; обнажающийся эндотелий (или даже коллаген стенки) запускает микросвертывание крови, резко повышает проницаемость капиллярной стенки для микроорганизмов, что влечетзза собой септицемию.
Значительная часть нейтрофилов (более 30 циркулирующих объемов) депонируется в костном мозге, капиллярах легких, селезенки и печени [Graddock et al., 1960; Fieschi, Sacchetti, 1964]. Общее количество циркулирующих в организме нейтрофилов составляет окооо 0,6—1,8х109 клеток/кг массы тела [Graddock et al., I960; Boggs, 1975], скорость продуцирования нейтрофилов составляет около 1,6 X Ю" клеток/(кг·сут) [Rothstein et al., 1978]. Полупериод циркуляции гранулоцитов в крови при метке диизопропилфлюорофосфатом составляет в среднем 6,5 ч | Fliedner et al., 1964;
Maloney, Patt et al., 1968, и др.1. После короткой циркуляции в сосудистом русле нейтрофилы мигрируют (в основном через посткапиллярные венулы) в ткани, где осуществляют свои основные функции по фагоцитозу микробных тел и клеточного детрита. Показано, что острое воздействие алкоголем и некоторыми токсинами снижает способность нейтрофилов к миграции [Cronkite 1979]. Таким образом, общая продолжительность жизни нейтрофилов, включая время генерации, при метке "Сг составляет, по Lajtha (1963), около 13 сут, причем время жизни нейтрофила в тканях всего около 2 сут [Bainton et al., 1971]. В циркуляцию из тканей гранулоциты не возвращаются. Подсчитано, что в легких и желудочнокишечном тракте разрушается около 66 нейтрофилов/10 кг массы тела в час [Потапова С. Г., 1976]. Небольшая часть пула нейтрофилов покидает организм через мочевыводящие пути.
У зрелых нейтрофилов, недавно мигрировавших из костного мозга, определяется отрицательный электрический потенциал на внешней стороне цитолеммы; этот потенциал снижается у долго циркулирующих нейтрофилов, а также у нейтрофилов пожилых людей [Marikowsky et al., 1966], что влечет за собой повышенную агглютинабельность гранулоцитов и сокращение сроков циркуляции.
В регуляции гранулоцитопоэза большую роль играет колониестимулирующий фактор (КСФ), вырабатываемый моноцитами и макрофагами, предварительно стимулированными Тлимфоцитами. КСФ представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 45 000. Установлено, что карбонат лития in vivo и in vitro стимулирует выработку КСФ, увеличивает количество колониеобразующих клеток КОЕГМ и общее число гранулоцитов в организме.
Гранулоцитарный кейлон, выделенный из зрелых и полузрелых нейтрофилов, способен обратимо подавлять синтез ДНК (действуя в фазе g]) в ядрах гранулоцитарных клеток-предшественниц, осуществляя таким образом отрицательную обратную связь [Rytomaa, 1973]. Гранулоцитарный кейлон является водорастворимым пептидом с молекулярной массой около 4000 (по другим данным, значительно легче—Paukowitz и соавт., 1978), он найден в экстрактах гранулоцитов, сыворотке крови, моче и др. При лейкозах выявлены значительные сдвиги кейлонового спектра.
Антикейлон является стимулятором гранулопоэза, он представляет собой белок с молекулярной массой 35 000—50 000 и, действуя в физиологических концентрациях, усиливает синтез ДНК в гранулоцитарных предшественниках [Rytomaa, Kivinieni, 1978].
Есть определенные данные, указывающие на стимуляцию гранулопоэза продуктами распада нейтрофилов [Курбанова Г. Н., 1979; Кахетелидзе М. Г. и др., 1980]. По-видимому, эффект на клетки-предшественницы опосредуется гуморальным путем (через гранулопоэтины?). Показана способность лейкоцитарнооо интерферона обратимо блокировать митотическую активность предшественников гранулоцитов [Verma et al., 1981].
В настоящее время в значительной мере расшифрованы сущность и формирование нейтрофильной зернистости. На стадии промиелоцита — первой морфологически распознаваемой нейтрофильной клетки — появляется азурофильная (лизосомальная) или так называемая первичная зернистость.
Ультрацитохимически установлено, что эта зернистость содержит миелопероксидазу (главный маркер), кислую фосфатазу, глюкуронидазу, фосфолипазы, нейраминидазу, гиалуронидазу, галактоцереброзидазу, небольшое количество кислой неспецифической эстеразы [Rodzum et al., 1980] и кате псина, а также фагоцитин, около 50% внутриклеточного лизоцима, катионные антибактериальные белки [Брауде А. Н., 1966; Boggiolini, Bretz et al., 1974; Bainton, 1975], активаторы кининогена и плазминогена и др.
Электронномикроскопически азурофильные гранулы представляются сферическими электронноплотными образованиями диаметром 5—8 нм, прилежащими к внутренней поверхности пластинчатого комплекса.
Начина со стадии миелоцита, появляются вторичные, или специфические, гранулы, причем их количество растет по мере созревания нейтрофила. Эти гранулы содержат коллагеназу, фагоцитин, лактофрррин, 50% лизоцима, гликоген и гликолитические ферменты; в непосредственной близости от них, в вакуолизированных органеллах, находится щелочная фосфатаза [Rustin et al., 1978]. Есть данные, что активность щелочной фосфатазы увеличиваетс пропорционально времени циркуляции нейтрофила [Вопdue et al., 1980].
На электронограммах форма вторичных гранул различная, диаметр около 2—5 нм, плотность относительно небольшая.
В сегментоядерных нейтрофилах специфическая зернистость составляет 70—90%, азурофильная — 10—30% [Bainton, 1975; Souillet et ll., 1975]. Показано, что в пожилом и старееском возрасте достоверно снижается активность внутриклеточной щелочной фосфатазы и гликогена нейтрофилов, а активность миелопероксидазы практически не меняется [Багренска М. и др., 1980]. Миелопероксидаза, лизоцим, фагоцитин и катионные белки составляют мощные антимикробные ферментные системы, активные против большинства представителей микрофлоры. Лактоферрин специфических гранул обладает бактериостатическим действием в отношении гемсодержащих бактерий, кроме того, установлено его ингибирующее десствие на гранулоцитарные предшественники [Broxmeyer et al., 1980].
В цитоплазме нейтрофилов содержатся ионы многих металлов — цинка, меди, магния, кобальта, железа, значительное количество аминокислот, относительно велико содержание гликогена, найден глютатион [Williams et al., 1977]. Зрелые гранулоциты активноввключают витамин В^, в составе зернистости найден В | ^связывающий протеин [Corcino et al., 1970]. Имеются внутриклеточные рецепторы к глюкокортикостероидам, в частности, к дексаметазону [Murakami, Brandon, 1979]. На плазменной мембране, митохондриях и в цитозоле выявлены 3 формы магнийзависимой аденозинтрифосфатазы [Smith et al., 1980].
Некоторые исследователи описывают третичные гранулы (С), содержащие кислую фосфатазу, описана и микросомальная фракция (гранулы D) со слабой активностью щелочной фосфатазы.
Важнейшее свойство нейтрофилов — способность к фагоцитозу, она определяет их роль в деструкции микробных объектов, инородных тел и клеточного детрита. И. И. Мечников в 1892—1908 гг. выделил основные этапы фагоцитоза: сближение фагоцита с микрообъектом, прилипание (аттракцию), поглощение и переваривание. В дальнейших исследованиях вскрыты детали этих процессов. В частности, оказалось, что факторы хемотаксиса возникают при взаимодействии микробной поверхности с сывороточными системами иммуноглобулинов и комплемента. Так, описана своеобразная каскадная система деградации компонентов комплемента с генерацией хемотаксических факторов. Она начинается с реакции антиген — антитело и активации компонентов комплемента С,, С4 и С;, в результате чего возникает хемотаксически активный комплекс С,^. Еще большую активность имеет комплекс СзТГ/, фрагменты компонентов Сз и С^, возникающие при реакции антиген — антитело [Ruddy et al.,11972], а также высвобождающийся эндотоксин, калликреин, активатор плазминогена, продукты окисления липидов и т.д.
Интимный механизм хемотаксического наведения нейтрофила во многом неясен, но, по-видимому, прежде всего имеют значение градиенты иммуноглобулинов и кальция [Williams et al., 1977], а также факторы, выделяемые сенсибилизированными Тлимфоцитами.
Инкапсулированные микроорганизмы (стрептококки, золотистый стафилококк и др.) фагоцитируются после опсонизации, в которой участвуют фрагменты компонента Сз и опсонизирующие антитела сыворотки (относящиеся к классу иммуноглобулинов G).
Бактериальные субстраты, прежде всего эндотоксин, активируют фактор Хагемана, который запускает процессы свертывания крови и фибринолиза.
После прилипания нейтрофила наблюдается образввание псевдоподий, замыкающих микробное тело в фагосому. Сразу же после прикрепления нейтрофила отмечается выраженная амебоидная активность, ее стимулируют глюкокортикостероиды [Рябов С. И., Величко А. Г., 1961).
В настоящее время установлено, что фагоцитоз — это активный биологический процесс, протекающий с многократно повышенным потреблением кислорода и глюкозы (за счет мобилизации внутриклеточного гликогена) и сопровождающийся усиленным синтезом фосфолипидов [Sbarra et a]., 1969; Eschenbach et al., 1981]. В процессе фагоцитоза утилизируемый клеткой кислород превращается в супероксидный анионрадикал (О^), в результате окисления НАДФ·Нд усиленно генерируется пероксид водорода, который обладает сильными окислительными свойствами. Выявлено универсальная дисмутаза, она содержится в нейтрофилах в относительно малых количествах (по сравнению с эритроцитами и лимфоцитами), с чем и связывают малюю длительность жизни нейтрофилов. Наиболее высокая активность супероксиддисмутазы наряду с неспособностью к экзогенной генерации 0^ констатирована у лимфоцитов, что, возможно, объясняет относильно большую длительность жизни некоторых субпопуляций лимфоцитов [Kobayashi et al, 1979].
На микробный объект, заключенный в фагосому, изливается по системе микротрубочек содержимое гранул нейтрофила—дегрануляция), а также образовавшиеся активные метаболиты, переоксидные и гидроксидные соединения. Миелопероксидаза, активированная пероксидом водорода, выделяется в фагосому и окисляет микробные белки [Klebanoff et al., 1967; 1972]. Миелопероксидазная система нейтрофилов способна инактивировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы, грибы, микоплазмы, но только в присутствии галогенов и пероксида водорода.
Под влиянием лизоцима (мурамидазы) происходитгидролиз гликопро·теидов бактериальной оболочки (в основном грамположительных бактерий), этот процесс усиливается в присутствии пероксида водорода и аскорбиновой кислоты. При острых лейкозах нередко наблюдается снижение активности внутриклеточного лизоцима [Яворковский Л. И. и др., 1977].
Фагоцитин — уникальная антибактериальная субстанция, он содержится только в гранулоцитах [Zeya et al., 1971] и обладает широким противомикробным спектром — в отношении и грамположительной, и грамотрицательной флоры.
Катионные белки гранулоцитов во многом определяют суммарную фагоцитарнуюаактивность клеток; лишенные катионных белков нейтрофилы найдены у больных острыми лейкозами и хроническим миелолейкозом, их фагоцитарная способность резко угнетена [Проценко В. А. и др., 1981].
В деструкции фагоцитированного материала участвуют иггидролазы, входящие в состав азурофильной зернистости (амилаза, а и рглюкозидазы, ргалактозидаза, глюкуронидаза), и полипептидазы (карбоксипептидаза, иминопептидаза, аминопептидаза, катепсин, коллагеназа, эластаза и др.) [Baggiolini et al., 1972]. В гранулах нейтрофилов найдены ДНКаза, РНКаза.
Выяснилось, что важную роль в фагоцитозе играет фибронектин — высокомолекулярный (молекулярная масса около 440 000) гликопротеин, широко распространенный в соединительной ткани (нерастворимая форма) и имеющийся в зглобулиновой фракции плазмы (растворимая форма) [ Моsesson, Amrani, 1980]. Молекула фибронектина состоит из 2 полипептидных цепей приблизительно равной массы, связанных дисульфидными группами. Вместе с коллагеном III типа фибронектин находится в ретикулиновых волокнах лимфоидных органов; он обнаружен инна поверхности эндотелия [Jaffe, Mosher, 1978]. Доказано, что он вырабатывается фибробластами и макрофагами [Pearlstein et al., 1980; Mosesson, Amrani, 1980].
Адсорбированные на поверхности макрофагов фибронектин и близкий ему гликопротеин ламинин и находящийся в плазме водорастворимый фибронектин (вместе с ионами С^ 1 и М^^) активно участвуют в процессах адгезии клетка — клетка и клетка — субстрат, регулируют хемотаксическое наведение, повышают сродство фибрина и коллагена к макроаагам [Ruoslanthi et al., 1981; Vakeri, KeskiOja et al., 1980]. В частности, мембранный фибронекти стимулирует поглощение макрофагами частиц желатина [Kleinтапп et al., 1981]. Рецепторы к фибронектину найдены на поверхности нейтрофилов [Зинкевич О. Д. и др., 1982] и моноцитов [Bevilagua et al. 1981].
Плазменный фибронектин способен наряду с иммуноглобулинами и комплементом опсонззировать некоторые микроорганизмы, прежде всего Staphylococcus aureus, но не кишечную палочку и микобактерии [Mosher, Furcht, 1981]. В эксперименте доказано, что снижение фагоцитарной активности после повторного введения фагируемого материала объясняется, в частности, снижением уровня плазменнгго фибронектина (его нормальная концентрация составляет около 300 мкг/мл по Moesher, Furcht). Известно, что введение криопреципитата при сепсисе или после больших операций уменьшает тяжесть инфекционных поражений.
Кроме того, фибронектин стимулирует адгезию тромбоцитов на коллагене, способен корригировать дисфункцию тромбоцитов при синдроме Элерса — Данлоса [Arneson et al., 1980] и, возможно, именно фибронектин определяет прилипание мононуклеаров к стенке культурального сосуда in vitro.
Есть данные, что фибронектин играет определенную роль в процессах клеточной дифференцировки; вместе со спектром коллагена он формирует лимфоидное микроокружение, определяющее инстинкт дома [Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980]. Относительно сниженное содержание мембранного фибронектина в некоторых опуоолевых клетках наряду с повышением выработки коллагеназ и других протеиназ, возмжжно, определяет характер и темп метастазирования (Kleinmann et al., 1981].