Культивирование тканей в гематологии
В настоящее время стала очевидной недостаточность только морфологического изучения кроветворных клеток, так как оказалось, что внешне одинаковые клетки имеют совершенно различные функции, т. е. по существу относятся к разным классам. Это прежде всего лимфоидные клетки, среди которых оказываются предшественники различных ростков гемопоэза, иными словами, гистогенетически различные элементы. Кроме того, хорошо известны те трудности, которые возникают при прогнозировании течения острого лейкоза и выборе схемы терапии, если основываться только на морфологическом исследовании лейкозных клеток.
В последние годы с помощью культур костного мозга получен ряд ·новых данных, расширяющих представления о патогенезе гемобластозов.
Изоляция кроветворных клеток in vitro и in vivo (эксплантация и трансплантация) позволяет оценить их пролиферативные и дифференцировочные потенции, выявить межклеточные взаимодействия, эффект различных гуморальных агентов, радиации, лекарственных средств и т. д. Культивирование взвеси кроветворных клеток in vitro, начатое в работах И. П. Скворцова (1885), Arnold (1887), Carrel, Burrows (1910), А. А. Максимова (1916—.1928), позволяет в суспензионных культурах в течение 1— 2 сут наблюдать затухающий гемопоэз, определять некоторые цитокинегические параметры — время генерации in vitro, включение меченых нуклеогидов, бласттрансформацию лимфоцитов в присутствии митогенов, фагоцитоз и т. д. Поддержать гемопоэз в таких культурах удается добавлением к питательной среде плазмы больных хроническим лимфолейкозом или гемолитической анемией [Швелидзе Т. И., 1981]. В этих условиях можно выявить определенные особенности цитокинетики культур при рззличных гемобластозах.
Наиболее ценными в теоретическом и практическом плане оказались методы клонирования in vitro клеточных кроветворных популяций. Отличительная черта этих методов — высев разобщенных клеток исходной взвеси в такую культуральную систему, где потомки делящихся клеток оказываются локализованными и доступны визуальному наблюдению, идентификации. цитохимическому и кариологическому анализу, а. также пересеву в следующую клонирующую систему. Именно агаровые и монослойные погружные культуры создали возможность клонировать клетки in vitro. Однотипность клеток, составляющих очаги таких культур, позволяет идентифицировать их как потомков одной клетки-предшественницы, т. е. клон.
Культуры гемопоэтических клеток в норме. С разработкой методов клонирования кроветворной ткани стало возможным количественное изучение клеток-предшественниц для различных ростков гемопоэза. В культуре получен рост колонийклонов из унипотентных коммитированных стволовых клеток (клеток-предшественниц), способных к ограниченному самоподдержанию и к дифференцировке в направлении только одного ростка. Клональный рост обеспечивается иммобилизацией одноклеточной суспензии в полутвердых средах (агаре, метилцеллюлозе, плазменном сгустке) и включением в питательную среду КСФ. Концентрация колониеобразующих клеток в исходных кроветворных тканях очень мала и поэтому их трудно идентифицировать морфологически.
Гранулоцитарномакрофагальные клетки-предшественницы (КОЕГМ). Метод агаровых культур позволяет клонировать Гранулоцитарномакрофагальные клетки-предшественницы (колониеобразующие единицы в культуре, КОЕК или КОЕГМ) у животных [Pluznik, Sachs, 1965; Bradley, Metcalf, 1966] и у человека [Pike, Robinson, 1970]. В нашей стране он впервые воспроизведен в лабораторииппрофессора И. Л. Черткова [Шерешков С. И., 1974]. Сущность данного метода заключается в том, что при эксплантации суспензии кроветворных клеток в строго определенных условиях и в присутствии КСФ на агаре в течение нескольких дней вырастают колонииклоны, состоящие из большого числа гранулоцитов, макрофагов или смеси обоих клеточных типов (рис. 35). Скопления из 50 и менее клеток называют кластерами.
Метод Pike, Robinson обеспечивает наиболее высокую и стабильную эффективность клонирования кроветворных клеток человека. Iscove и соавт. (1971) вместо агара используют метилцеллюлозу.
В двухслойной системе Pike, Robinson в качестве источника КСФ используют лейкоциты периферической крови донора, помещенныевв нижнем слое 0,5% агара, а тестируемые клетки эксплантируют в верхнем слое 0,3% агара.
Число КОЕГМ в расчете на каждые 1·105 высаженных в культуру клеток костного мозга здоровых взрослых людей составляет от 10 до 150 [Забелина Т. С. и др., 1977; Афанасьев Б. В. и др., 1982; Entringer et al„ 1977; Metcalf, 1979, и др.]. В периферической крови КОЕГМ содержится
Рис. 35. Колонии, образуемые потомством костномозговых гранулоцитарномакрофагальных клеток-предшественниц (КОЕГМ) в агаре.
на порядок меньше, чем в костном мозге [Richman et al., 1976]. Селезенка по содержанию КОЕГМ занимает промежуточное положение между костным мозгом и периферической кровью [Metcalf, 1979].
Содержание кластерообразующих клеток (КлОК) в культурах нормального костного мозга человека обычно в 5—10 раз превышает содержание КОЕГМ [Metcalf, 1979].
Опыты с пересевом единччных клеток показали, что КОЕГМ — общая клеткапредшественница для неитрофилов и моноцитов [Dao et al., 1977]. Изучены физические и пролиферативные характеристики КОЕГМ. Показано, что 20—40% КОЕГМ костного мозга взрослого человека быстро пролиферируют [Moore et al., 1973; Broxmeyer et al., 1976].
КОЕГМ человека весьма радиочувствительны. Их число в костном мозге снижаесся после введения цитостатических химиопрепаратов [Richman et al., 1976]. Изменения уровня КОЕГМ в кроветворных тканях человека при различных воздействиях более чувствительны, чем другие параметры гранулопоэза (клеточность, морфологический состав костного мозга). Так, при проведении химиотерапии миелосаном хронического миелолейкоза падение в крови числа КОЕГМ более выраженное и наступает раньше, чем снижение числа лейкоцитов [Greenberg et al., 1974; Douglas, Pickering, 1976].
Эритроцитарные клетки-предшественницы (КОЕК, БОЕЭ). В 1971 г. был разработан метод, позволяющий контролировать in vitro у мышей эритроцитарные клетки-предшественницы [Stephenson и соавт.), а в 1974 г. эта методика была использована для изучения таких клеток у человека [Террегman и соавт., 1774].
В 1982 г. Konwalinka и соавт. разработали систему микроагаровых культур для клонирования эритроцитарных клеток-предшественниц костного мозга человека. Nishihira, Kigasava (1981) получили рост человеческих эритроцитарных и эритроцитарногранулоиитарных колоний в культуре фибринного сгустка без добавления эритропоэтина (ЭП). В состав питательной среды они включали 2% сыворотки больных апластической анемией и кондиционнюю среду (КС) из стимулированных ФГА человеческих лейкоцитов. Такая система обеспечивает высокую эффективность клонирования.
Клетки-предшественницы мегакариоцитопоэза (КОЕМег). Разработана система для клонирования мегакариоцитарных клеток-предшественниц у мышей [Metcalf et al., 1975; Nekeff, DamelsMcQueen, 1976] и у человека [Vainchenker et al., 1979; Messner et al., 1982, и др.]. Рост колоний мегакариоцитов зависит от добавления в культуру КС из стимулированных селезеночных клеток. Williams и соавт. (1980) обнаружили фактор, стимулирующий рост мышиных мегакариоцитов и повышающий их плоидность, в супернатанте клеток костного мозга и перитонеальных макрофагов. Messner и соавт. (1982) улучшили культуральные условия и добились ряда больших, компактных мегакариоцитарных колоний. Таким образом, появилась возможность для изучения дифференцировки стволовых клеток и по пути мегакариоцитарного ростка.
Клетки-предшественницы лимфопоэза (КОЕЛ). Наиболее трудными для клонирования в культуре in vitro оказались лимфоцитарные клетки-предшественницы. В 1975 г. Metcalf и соавт. разработали систему культивирования, которая обеспечила пролиферацию мышиыых Влимфоцитов (КОЕЛв) в полутвердом агаре. В этой системе добавление 2меркаптоэтанола необходимо для выживания и пролиферации лимфоцитов. Образование колоний Влимфоцитов отличается тем, чоо оно не требует добавления специфического фактора, стимулирующего рост колоний.
Получен рост человеческих Влимфоцитарных колоний in vitro [Radney et al., 1979]. Однако наиболее полные характеристики КОЕЛв полччены в ыышиной системе.
В агаровой культуре получен рост колоний из мышнных [Sredni et al., 1976] и человеческих [Rosenxajan et al., 1975; Fibach et al., 1976, и др.] ФГАстимулированных Тлимфоцитов (КОЕЛт). В начальных работах по клонированию Тлимфоцитов не удалось полччить линейной зависимости между числом высаженных клеток и числом образующихся колоний. Pancet, Testa (1982) показали, что человеческие Тлимфоцитарные колонии, растущие на поеерхности агара при стимуляции ФГА, возникают более чем из 1 предшественницы: они содержат оба типа фермента ГбФД, когда донор был гетерозиготен по изоэнзимам.
В 1979 г. Lowenberg, De Zeeuw разработали метод клонирования человеческих Тлимфоцитов с линейной зависимостью между числом высаженных клеток и числом образующихся колоний. Авторы использовали двухслойную систему: в нижнем слое агара помещали лейкоциты периферической крови донора, облученные дозой 20 Гр, а тестируемые клетки костного мозга и ФГА помещаливв верхнем слое без агара. Авторы установили, что большинство колониеобразующих клеток содержится во фракции стволовых клеток, доказывая тем самым, что колонии происходят из лимфоцитарных предшественниц.
Гемопоэтические клетки-предшественницы, формирующие колонии в диффузионных камерах in vivo (КОЕДК). Gordon в агаровой среде в дфффузионных камерах, имплантированных внутрибрюшинно (предварительно облученным) мышам, получила клональный рост гранулоцитарно макрофагальных клеток-предшественниц (КОЕДК) из костного мозга мышей (1974) и человека (1975). Этот метод воспроизведен в нашей .стране в лаборатории проф. И. Л. Черткова [Горбунова И. А., 1979]. По концентрации в различных кроветворных тканях мышей, а также по морфологическому составу образующихся в культуре колоний КОЕДК аналогичны КОЕГМ. Однако по физическим характеристикам [Jacobson et al., 1979], а также по радиочувствительности [Колесникова А. И. и др., 1980, 1982;
Gordon, 1975] и способности инактивироваться кроличьей сывороткойппротив головного мозга мышей [Колесникова А. И. и др., 1982] КОЕДК отличаются от КОЕГМ, и по уровню дифференцировки они, по-видимому, стоят ближе к КОЕС — стволовым кроветворным клеткам. Для поддержания гранулопоэза в диффузионных камерах требуется иной, чем КСФ, фактор роста, который пока не идентифицирован. Этот фактор роста обеспччивает организм хозяинареципиента.
Steinberg и др. (1976) в плазменном сгустке в диффузиннных камерах получили клональный рост гранулоцитарных (КОЕГМ) и эритроцитарных (КОЕЭ, БОЕЭ) клеток-предшественниц.
В плазменном сгустке диффузионных камер получен также рост мегакариоцитарных колоний, однако эффективность клонирования и клеточность колоний значительно меньше, чем в культурах in vitro [Paulus et al., 1980]. Таким образом, с использованием диффузионных камер появилась возможность изучать гемопоэтические клетки-предшественницы in vivo.
Полипотентные клетки-предшественницы в культуре (КОЕГЭММ).
В полутвердой культуральной системе получен рост колоний, состоящих из 5 различных типов мышиных гемопоэтических клеток: эритроцитов, нейтрофилов, макрофагов, зозинофилов и мегакариоцитов [Johnson, Metcalf, 1977; Metcalf et al., 1979]. Такие клетки, образующие в культуре смешанные колонии, были названы КОЕГЭММ. Клетки из таких колоний оказались способными к формированию типичных селезеночных колоний у сингенных летально облученных реципиентов, а также к образованию вторичных смешанных колоний в пересевных культурах, что свидетельствует об их способности к самоподдержанию в культуре. Анализ колоний показал, что каждая является клоном, развивающимся из одной полипотентной клетки I Metcalf et al., 1980].
В последующих работах рост смешанных гемопоэтических колоний получен и в культурах человеческого костного мозга, периферической крови и крови сердца при добавлении к культурам КС из стимулированных ФГА лейкоцитов периферической крови [Fauser, Messner, 1978, 1979]. Помимо такой кондиционированной среды или ФГА, в состав питательной среды входят культуральная среда, эмбриональная телячья сыворотка, эритропоэтин, метилцеллюлоза [Fauser, Messner, 1978] или агар [Messner et al., 1980]. Эритропоэтин требуется для созревания эритроцитарных предшественниц в смешанных колониях. Концентрация КОЕГЭММ, БОЕЭ и КОЕК, по данным Messner, Fauser (1980), составила в среднем соответственно 10,120 и 70 на 1·10s нормальных клеток костного мозга. Следовательно, смешанные колонии составляют приблизительно 5% всех образующихся в культуре колоний.
В опытах с Н тимидином показано, что КОЕГЭММ человека в отличие от КОЕК и БОЕЭ являются покоящимися клетками, способными в период регенерации (после трансплантации) активно пролиферировать [Pauser, Messner, 1979].
Таким образом, по пролиферативной активности в нормальном состоянии и в условиях регенерации, а также по способности к самоподдержанию КОЕГЭММ аналогичны КОЕС. Однако, анализируя отношение КОЕГЭММ и КОЕС, Metcalf (1981) приходит к выводу о том, что КОЕГЭММ, вероятнее всего, представляют собой комбинацию более зрелых КОЕС.
Полипотентные клетки-предшественницы оказались гетерогенной популяцией клеток с различными дифференцировочными потенциями. К ним, помимо КОЕГЭММ, можно отнести клетки, занимающие промежуточное положение между КОЕГЭММ и унипотентными КОЕ: полипотентные КОЕГЭМ и КОЕГММ, образующие в культуре колонии из 3х типов миелоидных клеток, а также бицотентные КОЕГМ, КОЕГЭ и КОЕЭМ, образующие колонии из 2 типов миелоидных клеток.
Nakahata, Ogava (1982) показали, что в культурах костного мозга и селезенки мышей на кондиционной среде из митогенстимулированных селезеночных клеток через 16 дней образуются колонии, содержащие по 40— 1000 бластных клеток без признаков терминальной дифференцировки. Опыты с пересевными культурами показали способность клеток из таких колоний образовывать вторичные и третичные колонии из бластных клеток. Анализ индивидуальных колоний показал высокое содержание в них КОЕС и КОЕГЭММ. Такие колонии, как считают авторы, образуются из стволовых клеток (КОЕС).
Таким образом, созданы методы культивирования in vitro, обеспечивающие возможности изучения пролиферации и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток у мышей без трудоемкой методики селезеночного колониеобразования и у человека, для которого подобная система in vivo невозможна.
Максимально стимулированные агаровые культуры нормального костного мозга и периферической крови человека являются полезным лабораторным методом, подтверждающим и расширяющим данные, полученные при морфологических исследованиях. Они особенно важны при изучении ряда заболеваний системы крови.
Стромальные клетки-предшественницы, формирующие колонии фибробластов в культуре (КОЕФ). При посеве в плоскодонные сосуды с питательной средой, гепарином и плазмой относительно небольшого количества клеток костного мозга грызунов с 3—6го дня в культурах формируются дискретные колонии — клоны фибробластоподобных клеток [Чайлахян Р. К., 1970] (рис. 36). Показано, что число колоний в этих условиях линейно зависит от количества эксплантированных ядросодержащих клеток костного мозга. Эти клетки являются стромальными предшественниками (т. е. механоцитами), гистогенетически обособленными от кроветворной паренхимы и сохраняющими способность переносить и строить гемопоэтическое микроокружение, пригодное для дальнейшей репопуляции кроветворными клетками [Панасюк А. Ф., Лурия Е. А., 1970; КейлисБорок И. В. и др., 1971; Фриденштейн А. Ф., Лалыкина К. А., 1973, и др.].
Затем было установлено [Панасюк А. Ф. и др., 1972; Смирнов А. Н., 1974], что концентрация стромальных клеток-предшественниц в костном мозге человека составляет около 1·10~5 клеток, они относительно радиочувствительны, их потомки способны к длительному росту в монослойной культуре в виде диплоидного штамма. В интактном организме колониеобразующие клетки-предшественницы фибробластов (КОЕФ) находятся вне митотического цикла. Применение ксенофидера из клеток костного мозга грызунов, облученного в дозе 40 Гр, позволяет стабилизировать эффективность колониеобразования [Кулагина Н. Н. и др., 1981]. Выявить в крови человека циркулирующие КОЕФ не удается.
Предшественники фибробластоподобных клеток в костн&м мозге не идентифицированы, но, вероятнее всего, они относятся к преостеобластам [Фриденштейн А. Я., Лалыкина К. А., 1973; Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А.,
1980]. КОЕФ не содержат 1аантигена, секретируют фибронектин и коллаген I и III типов, т. е. являются механоцитами [CastroMalaspina et al., 1980].
А. И. Колесникова, С. К. Хоптынская с соавт. обнаружили значительную вариабельность числа КОЕФ в костном мозге у лиц разного возраста. Показано, что относительное и абсолютное содержание КОЕФ в костном мозге грудины существенно выше, чем в костном мозге подвздошной кости [Колесникова А. И. и др., 1982]. Концентрация КОЕФ в костном мозге с возаастом снижается.
Гемопоэз в длительных культурах. Помимо клональных методов, разработаны методы культивирования, обеспечивающие взаимодействие стромальных и кроветворных клеток и вследствие этого длительное поддержание в них кроветворения. К таким методам относятся органные культуры и система Декстера.
Метод органных культур разработали Е. А. Лурия, И. Е. Пьянченко
в 1966 г. Сущность его заключается в том, что на миллипорные фильтры на разделе двух фаз (жидкой — питательной среды и газовой — воздуха или смеси воздуха с 5% СО^) эксплантируются не разобщенные кроветворные клетки, как в клональных методах, а клетки вместе с окружающей их стромой. В таких культурах обеспечивается взаимодействие стромаль
ных и кроветворных клеток, что приводит к длительному поддержанию в них кроветворения.
В органных культурах костного мозга человека из фрагментов ребер [Смирнов А. Н.,11974] или из материала трепанатов [Колесникова А. И., 1974] в течение 2—3 нед поддерживается кроветворение. Происходит дифференцировка до сегментоядерных нейтрофилов [Воробьев А. И. и др., 1971]. Эритропоэз угасает к 3—5м суткам, лимфопоэз не поддерживается. В отличие от других методов культивирования, продолжается мегакариоцитопоэз без отшнуровывания тромбоцитов [Смирнов А. Н., 1974]. В органных культурах кроветворной ткани в течение 2—3 нед пролиферируют стволовые кроветворные клетки [Лациник Н. В. и др., 1978 Харламова Л. А. и др., 1975].
В 1977 г. Dexter с соавт. разработали систему, обеспечивающую пролиферацию и дифферннцировку стволовых кроветворных клеток на протяжении нескольких месяцев. В этих культурах вначале выращивается подложка из прилипающей популяции клеток костного мозга, состоящая из жировых, эндотелиальных клеток, макрофагов и фибробластов. Через 2—3 нед в культуру высаживают свежие костномозговые клетки, их взаимодействие с клетками подложки и обеспечивает длительное поддержание кроветворения. Такая система воспроизведена и для длительного культивирования костного мозга человека Moore и соавт. (1979).
В такой культуре возможно поддержание гранулопоэза до 10—12 нед [Dexter et al., 1977, 1978], наблюдаются многочисленные мегакариоциты [Гуревич О. А. и др., 1982].В культурах костного мозга человека до 5й недели определяются бурстобразующие клетки, а поздние эритропредшественницы — до 9й недели; в 5недельных культурах костного мозга человека доказано присутствие Тлимфоцитов [Hocking, Golde, 1980].
Показательно, что очаги гранулопоэза во всех случаях ассоциированы с пролиферирующими клетками прилипающего полислоя — фагоцитирующими моноцитами, агрегатами эпителиоидных клеток и клеток, синтезирующих липиды [Фриденштейн А. Я., Лурия Е. А., 1980]. По-видимому, именно прилипающий слой в таких культурах достаточно хорошо имитирует кроветворное микроокружение, существующее in vivo в костном мозге, хотя бы для гранулопоэза. Следовательно, органные культуры и система Декстера позволяют изучать интимные механизмы взаимодействия между кроветворными и стромальными клетками, структуру стромального микроокружения и его роль в поддержании гемопоэза как у животных, так и у человека.