Исследование противосвертывающих механизмов
Антитромбопластиновая активность сыворотки [Балуда В. П., 1961] определяется по инактивации тромбопластина при смешивании его с испытуемой сывороткой. Норма 100±10%. Гемолиз искажает результаты исследования. Снижение наблюдается при наклонности к тромбозам.
Определение п регрессивно д ействующих а н т итромбинов (антитромбина III). Используются различные модификации методики Hensen, Loeliger (1963) и близкой к ней методики Abildgaard с соавт. (1970). Исследуемая плазма дефибринируется (прогреванием, змеиным ядом или другими способами), после чего в нее добавляют стандартное количество тромбина. Смесь инкубируют при 37°С, а затем тестируют на растворе фибриногена, или адсорбированной плазме через Лабораторная диагностика дефицита факторов VII, X, V и II в системе определения протромбинового времени
Добавляемые компоненты из нормальной крови или другие ферментыРезультаты коррекцииПервый вариантВторой вариантТретий вариантЧетвертый вариантАдсорбированнаяНормализаНормализаНормализаНормализаплазма без факции нетции нетцияции нетторов VII, 11, Х
Остаточная тромбиновая активность может также определяться на хромогенных субстратах.
Имеются и иммунологические методы определения антитромбина III.
Исследование антитромбина III имеет первостепенное значение для диагностики наследственных и приобретенных тромбофилий, истощения антитромбина III при развитии синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, тромбоэмболий и лечении гепарином. Антикоагулянтное действие гепарина почти не реализуется при глубоком дефиците антитромбина III [Баркаган 3. С. и др., 1979, 1980, 1982].
Определение быстродействую щи х антитромбинов. Изучается немедленное влияние плазмы больного на тромбиновое время стандартной нормальной плазмы в 5 пробирках (по Саеп и соавт., 1968 — см. В. П. Балуда и соавт., 1980). Результат оценивается по сравнению с таким же исследованием нормальной плазмы. Стабильной нормы нет.
Определение гепаринорезистентности плазмы с помощью серийного гепари нт ромбинового теста (по К. М. Бишевскому, 1979). К исследуемой и контрольной нормальной плазме добавляют растворы гепарина, удлиняющие тромбиновое время с 15—16 до 30—35 с (первая концентрация) и до 90—110 с (вторая концентрация). Путем сравнения исследуемой и нормальной плазмы по тромбиновому времени определяют (в процентах) индексы активации антитромбина (норма 82—118%) и антитромбиновый резерв плазмы (85—115%). Отношение антитромбинового резерва плазмы или индекса активации антитромбина к уровню антитромбина III в плазме в норме составляет единицу (от 0,9 до 1,1). Индекс активации антитромбина и антитромбиновый резерв плазмы снижаются при дефиците антитромбина 111, при его аномалиях, сопровождающихся снижением сродства к гепарину, а также при повышенном содержании в плазме белков, связывающих и инактивирующих гепарин (белки острой фазы, некоторые парапротеины и др.). При инфаркте миокарда, тромбоэмболиях, многих воспалительных и иммунных процессах выраженная гепаринорезистентность выявляется даже при нормальном или слегка сниженном уровне антитромбина III в плазме.
Метод весьма информативен для выявления тромбофилического сдвига в системе гемостаза, важен для правильного подбора доз гепарина. По информативности и точности он намного превосходит применявшийся ранее тест толерантности к гепарину.
Появление в крови иммунных и нгибиторов отдельных факторов свертывания крови и их титр определяют тестами смешивания и в системах количественного определения соответствующих факторов [Баркаган 3. С., 1975, Балуда В. П. и др., 1980].
Патологические белковые ингибиторы свертывания (волчаночный антикоагулянт, парапротеины и др.) определяются в основных коагуляционных тестах путем смешивания в разных соотношениях исследуемой и нормальной плазмы. Повторное исследование проводится после удаления ингибитора (препаративное фракционирование, плазмаферез).
Методы исследования фибринолитической системы крови
Для исследования фибринолитической системы предложено очень много разнообразных методик [Андреенко Г. В., 1981]. В клинике оправдали себя следующие методы, отличающиеся оперативностью, технической простотой, достаточно полной оценкой основных звеньев этой системы.
Спонтанный лизис сгустков легко определяется визуально или с помощью приборов, регистрирующих процесс свертывания и последующего разжижения крови (тромбоэластография, коагулография). По методу М. А. Котовщиковой, Б. И. Кузника (1962) лизис оцениваю! по выпадению из сгустка в осадок эритроцитов. Е. П. Иванов (1972) внес в эту методику поправку на количество фибриногена в исследуемой крови. Норма составляет 10—20% (за 3 ч инкубации).
Метод определения фибринолиза по Бидвелл — Андреенко [Андреенко Г. В., 1962]. Определяют убыль фибрина из сгустков в процессе их инкубации при 37°С. Контролем служат такие же сгустки, инкубированные при 4°С. Сгустки растворяют в растворе едкого натра и фибриноген определяют колориметрически с помощью реактива Фолина — Чокалтеу. Норма 15—25% лизиса за сутки инкубации. Метод неоперативен, дает ошибки, связанные с образованием продуктов деградации фибриногена с концевыми тирозиновыми группами [Балуда В. П. и др., 1980].
Эуглобулиновый лизис. Используется в нескольких однотипных методиках, из которых наиболее операиивен способ Коваржика — Булука. В кислой среде при низкой температуре осаждается эуглобулиновая фракция, содержащая плазминоген и его. активаторы, факторы свертывания плазминогена или избытка антиплазминов. Оно характерно для предтромботического состояния системы фибринолиза.
Определение продуктов фибринолиза в дефибринированной плазме и сыворотке используется для распознавания внутрисосудистой активации фибринолитическйй системы, обычно наступающей вслед за внутрисосудистым свертыванием крови. В диагностической практике используются следующие тесты:
— иммунологические, которые подразделяются на полуколичественные экспрессметоды, выполняемые за 5 мин (тесты латексовой агглютинации и ее торможения, преципитации и др.), и более точные, но выполняемые в течение часа и более количественные методики. Норма в разных тестах неодинакова (чаще до 0,1 г/л);
— тест склеивания стафилококков, основанный на способности ранних продуктов деградации фибриногена (фрагментов Х и Y), а также их комплексов с фибриномерами и поздними продуктами фибринолиза (фрагментами D и Е) вызывать неиммунную агглютинацию некоторых штаммов стафилококка [Hawiger et al., 1970; Lipinski et al., 1971, и др.]. Для проведения теста отбирают штаммы стафилококков с низкими антигенными свойствами и высоким содержанием склеивающего фактора, связывающегося с фрагментами Х и Y. Один из таких мутантов стафилококка, позволяющий достаточно быстро определять в сыворотке ранние продукты деградации фибриногена, получен в нашей лаборатории А. Момотом и Н. В. Черкашиным. Чувствительность этого диагностикума 1 мкг/мл. Норма 6,4 ± ± 1,3 мкг/мл;
— химическое определение по тирозину (проба Nanniga, Guest, 1967, в разных модификациях). Продукты деградации фибриногена, как и фибриноген, содержат концевые тирозиновые группы. Их определяют количественно в дефибринированной плазме или сыворотке. Нормаддо 0,1 г/л (в среднем 0,073 ± 0,039 г/л).
Недочетом всех этих определений является то, что при массивном внутрисосудистом свертывании крови образуются растворимые фибринмономерные комплексы (растворимый, плохо свертывающийся фибрин), завышающие показания тестов. Следует учитывать и то, что в эти комплексы уходит часть продуктов деградации фибриногена, особенно ранних; разграничить фибринмономерные комплексы и продукты деградации фибриногена очень трудно. В клинических условиях к этому стремиться не следует, поскольку нарастание и тех, и других говорит о выраженном внутрисосудистом свертывании крови.