Методы исследовнния внутреннего механизма свертывания
Функциональные методы можно разделить на: нестандартизированные тесты, дающие большие колебания нормальных показателей и выявляющие лишь наиболее грубые нарушения гемокоагуляции и стандартизированные по контакту и фосфолипидной активации одно и двухступенчатые пробы. К первой группе относятся определение времени свертывания цельной крови, время свертывания рекальцифицированной цитратной плазмы (время рекальцификации) и некоторые другие тесты, ко второй—каолиновое иремя свертывания крови и плазмы, парциальное тромбопластиновое время плазмы (кефалиновое время), активированное парциальное тромбопластиновое время (каолинкефалиновое время плазмы), аутокоагуляционный тест но Беркарду и соавт. (1965), тест генерации тромбопластина и ряд других методик.
Время свертывания крови — нестандартизированная проба, используемая для ориентировочного исследования свертываемости непосредственно у постели больного. Норма в большинстве методов—5—11 мин. Удлинение наблюдается при глубоком дефиците любого фактора свертывания крови, кроме факторов VII и XIII, а также после введения гепарина, активаторов фибринолиза (стрептокиназы, урокиназы), дефибринирующих препаратов (арвин, анкрод и др.), при лечении антикоагулянтами непрямого действия, при* накоплении в крови продуктов фибринолиза (диссеминированного внутрисосудистого свертывания синдром и др.). При нормальном тромбиновом времени удлинение времени свертывания крови наблюдается при наследственном или приобретенном дефиците или ингибиции факторов VIII, IX, X, XI, XII, V или II.
Тест непригоден для контроля за заместительной терапией и предоперационной подготовки больных гемофилией, поскольку нормализуется уже при 4% содержании факторов VIII и IX в плазме, тогда как надежный гемостаз обеспечивается лишь при повышении уровня этих факторов более 2530%.
Резко укорачивается время свертывания крови при гиперкоагуляции, тромбофилических состояниях, в начальной фазе синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания. В этих ситуациях кровь нередко свертывается в игле во время ее получения либо в пробирке до начала исследования. Такая гиперкоагуляция весьма показательна и характерна для тромбофилии и начальной фазы синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, если только она не связана с трудностями извлечения крови из плохо выраженных вен.
Стандартизированные по контакту и фосфолипидной активации одноступенчатые пробы — легко выполнимые и чувствительные тесты, змменившие вышедший из употребления метод определения времени рекальцификации плазмы, ошибка которого составляет ± 100% и более.
Для стандартизации контактной активации системы свертывания в плазму до ее рекальцификации вводят навеску легкого каолина (каолиновое время плазмы, норма 60—70 с), а для стандартизации фосфолипидномембранной активации — кефалин и эритрофосфатид (кефалиновое время плазмы или парциальное тромбопластиновое время, норма 55—56 с). В каолинкефалиновом тесте (активированное парциальное тромбопластиновое время, норма 45—55 с) добавляются оба ингредиента. В каждой лаборатории нормы уточняются применительно к используемым реактивам и вариантам анализов. Для всех тестов кровь получают и обрабатывают, используя силиконированные инструменты и посуду (!).
Все перечисленные пробы, особенно активированное парциальное тром
Рис. 169. Аутокоагулограмма и ее параметры у здорового человека. Восходящая часть кривой характеризует нарастание протромбиназнотромбовидной активности; нисходящая — динамику инактивации тромбина прогрессивно действующими антитромбинами бопластиновое время, просты, отличаются высокой точностью, воспроизводимостью и чувствительностью. Их показания нарушаются в сторону гипоили гиперкоагуляции по тем же причинам, что и время свертывания крови. Однако если время свертывания крови не выявляет дефицита факторов VIII и IX при их уровне выше 4%, то активированное парциальное тромбопластиновое время удлинено даже при уровне этих факторов выше 10%, оно часто используется и для контроля за гепаринотерапией.
Аутокоагуляционный тест по Berkarda с соавт. (1965) и микрокоагуляционный тест по Л. 3. Баркагану (1978)—двухступенчатые динамические стандартизированные по контакту и фосфолипидной активации пробы. Они отражают динамику образования и инактивации тромбина в исследуемой крови, не требуют никаких специальных реактивов, кроме 0,222% раствора хлорида кальция. 0,1 мл стабилизированной цитратом крови обследуемого смешивают с 2 мл гипотонического раствора хлорида кальция, в результате чего образуется гемолизаткальциевая смесь, в которой начинается процесс активации протромбина и превращения его в тромбин. Эту смесь в разные сроки (в первые 10 мин исследования, через, каждые 2 мин, затем через каждые 10 мин) добавляют к равноуу объему плазмы обследуемого. Тромбин, содержащийся в гемолизаткальциевой смеси, вызывает свертывание этой плазмы тем более быстрое, чем выше его концентрация. В норме максимум свертывающей активности наблюдается на 10й минуте инкубации смеси и составляет 10 ± 1 с, что равно 100% активности по кривой разведения. Затем происходит постепенная инактивация тромбина в смеси, в связи с чем ее свертывающая активность снижается (в 1,8—2,2 раза к 60й минуте, см. рис. 169). Эта инактивация в наибольшей степени связана с действием прогрессивных антитромбинов, в основном антитромбина III [Баркаган Л. 3., Цемахович В. А., 1978], в связи с чем соотношение свертывающей активности на 10й и 60й минутах может служить индексом естественной инактивации тромбина.
В микрокоагуляционном тесте тромбиновую активность гемолизаткальциевой смеии определяют не на плазме обследуемого, а на нативной нормальной плазме. Это снижает расход крови до 0,1 мл, что делает тест удобным в педиатрической практике.
Результаты аутокоагуляционного и микрокоагуляционного тестов полностью совпадают [Баркаган Л. 3., 1980].
По чувствительности к дефициту факторов свертывания аутокоагуляционной и микрокоагуляционный тесты, являясь двухступенчатыми пробами, превосходят активированное парциальное тромбопластиновое время. Они хорошо воспроизводимы, их можно использовать для дифференцировки разных видов гемофилии, а в сокращенной модификации (в одной пробирке на 10й минуте инкубации гемолизаткальциевой смеси) — для контроля за гепаринотерапией.
Причины нарушения аутокоагуляционного и микрокоагуляционного тестов те же, что и сдвигов времени свертывания крови.
Дифференциальная диагностика гемофилии. Все дифференцирующие тесты основаны на принципе коррекции, т. е. на том, устраняется ли обнаруженное нарушение свертываемости плазмы специально приготовленными образцами плазмы с заведомо известным дефицитом того или иного фактора свертывания. С этой целью в двухступенчатых пробах (аутокоагуляционный, микрокоагуляционный тесты, тест генерации тромбопластина и др.) изучается свертывание при последовательном добавлении в реагирующую смесь адсорбированной сульфатом бария нормальной плазмы, нормальной старой сыворотки (24 ч хранения) и других ингредиентов (табл. 3).
в первой готовят обычную гемолизатаальциевую смесь, во вторую вводят вслед за раствором хлорида кальция плазму здорового человека, адсорбированную сульфатом бария или гидроокись алюминия (0,1 мл), и вслед за этим 0,1 мл исследуемой крови, в третью — 0,1 мл нормальной старой сыворотки и 0,1 мл исследуемой крови. На 4й минуте инкубации свертывающая активность всех этих смесей тестируется на плазме исследуемого (аутокоагуляционный тест) либо на фибриногене или нормальной адсорбированной плазме (микрокоагуляционный тест). Если свертывание нормализуется в смеси с нормальной адсорбированной плазмой, в которой есть фактор VIII, но нет фактора IX, то у обследуемого больного гемофилия А, если нормализация происходит только под влиянием старой сыворотки (источник фактора IX), то у больного гемофилия В. При нормализации свертывания под влиянием как адсорбированной,плазмы, так и сыворотки следует думать о дефиците фактора XI (гемофилия С) или фактора XII, поскольку они содержатся и в плазме, и в сыворотке. Если коррекции нет ни в одной из пробирок, то можно предположить присутствие в крови больного иммунных ингибиторов факторов VIII, IX или XI—XII. В этом случае проверяют, не нарушает ли плазма больного свертывание нормальной плззмы.
Тест генерации тромбопластина (по Биггс — Дугласу — Макфарлану) использует те же виды коррекции, но выполняется в нескольких пробирках и отражает кинетику нарастания протромбиназной активности.
Тесты смешивания. В них используются заранее заготовленные в мелкой расфасовке образцы плазмы больных с заведомо известным глубоким дефицитом (менее 1%) факторов VIII, IX, XI, XI и др. Предварительно устанавливают, что в этих образцах нет иммунных ингибиторов соответствующих факторов (плазмы с ингибиторами для диагностического использования непригодны!). Эти эталоны хранят при температуре —25(—30°С). После оттаивания они непригодны для повторного замораживания и использования.
В тестах смешивания 0,2 мл плазмы с известным дефицитом фактора смешивают с 0,8 мл исследуемой плазмы, после чего определяют активированное парциальное тромбопластиновое время или выполняют коррекционные пробы в системе аутокоагуляционного теста.
Если добавленная плазма исправляет дефект свертывания, то в ней и в исследуемой плазме имеется дефицит разных факторов свертывания, если не исправляет, то в них один и тот же дефект.
Лабораторная диагностика нарушений внутреннего механизма свертывания (при нормальном протромбиновом и тромбиновом времени)