Патология гемостаза
ОБЩАЯ МЕТОДОЛОГИЯ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА
ОСНОВНЫЕ МЕТОДИКИ И ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ ТОЛКОВАНИЕ
Используемые в клинике методы исследования системы гемостаза можно разделить на: характеризующие тромбоцитарнососудистый гемостаз;
коагуляционный гемостаз, состояние системы фибринолиза и выявляющие внутрисосудистое свертывание крови и вторичную активацию фибринолиза.
Наиболее широко используются функциональные методики, отражающие участие разных звеньев и компонентов системы в гемостатических реакциях и поддержании жидкого состояния крови. Реже его определяют по эстеразной активности факторов свертывания крови и фибринолиза на белковых, синтетических и хромогенных субстратах [Бокарев И. Н. и др., 1980, 1982]. В ряде случаев используют и иммунологическое определение компонентов системы и их дериватов. Параллельное применение функциональных и иммунологических методик позволяет разграничивать разные молекулярные варианты дефицита компонентов системы гемостаза — формы, связанные с нарушением их синтеза (при них уровень антигенного маркера и функциональная активность компонента снижены одинаково), и варианты, при которых исследуемый фактор синтезируется в функционально неполноценной форме. В последнем случае низкая активность компонента сочетается с нормальным или почти нормальным содержанием его антигена в плазме.
Иммунологические тесты широко используют и для идентификации внутрисосудистого свертывания крови и фибринолиза. С их помощью определяют фибринопептиды, продукты деградации фибриногена (ПДФ), а также появление в крови новых антигенных маркеров (так называемых неоантигенов), образующихся при взаимодействии тромбина с антитромбином III, плазмина с антиплазмином [Collen, 1977, 1980].
Тесты, характеризующие тромбоцитарнососудистый гемостаз
Методы определения резистентности (ломкости) микрососудов. Ориентировочно о повышенной ломкости капилляров судят по положительной пробе щипка — образованию синяка при сдавлении складки кожи в подключичоой области и геморрагиям в местах инъекций. Точнее резистентность капилляров определяют с помощью манжеточной пробы (пробы со жгутом) Кончаловского — Румпеля — Лееде. В модификации Borchgrevink (1971) тест выполняется следующим образом: на верхней части ладонной поверхности предплечья очерчивают круг диаметром 5 см, после чего манжетой от аппарата для измерения артериального давления сжимают плечо в течение 5 мин при давлении 90—100 мм рт. ст. Через 5 мин после снятия манжеты подсчитывают число петехий в очерченном круге.
Баночная проба (по Нестерову): на ладонные поверхности обоих предплечий накладывают баночки от аппарата Нестерова, в которых отсасыванием создается разрежение — 150 мм рт ст. Через 1 мин проверяют, появились ли петехий. В зависимости от полученных результатов давление ступенеобразно понижают на 25 мм рт. ст., каждый раз с одноминутной экспозицией. При нормальном гемостазе петехий появляются при —197 ± ± 7 мм рт. ст., а в случае сниженной резистентности капилляров — при более высоком давлении.
Сосудистые пробы положительны при всех тромбоцитопениях с содержанием кровяных пластинок в крови ниже 40—60·Ю^л, а также при многих первичных и симптоматических качественных дефектах и дисфункциях тромбоцитов, в том числе при гемобластозах, уремии, Сгиповитаминозе. У некоторых женщин тесты положительны без патологии тромбоцитов, особенно при менструации.
Методы определения врем ени кровотечения. В пробе Дьюка [Duke, 1910] определяют время кровотечения из прокола кожи (глубина 3,5 мм) у нижнего края мочки уха (норма—до 4 мин). Более чувствительны методы, в которых время кровотечения определяется на фоне венозного стаза и повышенного давления крови в капиллярах, для чего на плечо накладывают манжету тонометра и в ней поддерживают давление 40 мм рт. ст. В тесте Айви [Ivy et al., 1941] на фоне такого венозного стаза прокалывают кожу на ладонной поверхности предплечья на глубину 3 мм, в методе Борхгревинка — Ваалер [Borchgrevink, Waaler, 1958] делают поперечные надрезы кожи глубиной 1 мм и длиной около 8 мм, по А. С. Шитиковой (1975) прокалывают кожу на концевой фаланге пальца и погружают ее в сосуд с определенным количеством подогретой воды. При этом определяют не только время кровотечения, но и количество теряемой крови (колориметрически). Норма времени кровотечения по Айви и Шитиковой — до 8 мин, по Борхгревинку— Ваалер —до 10—12 мин. Оно удлиняется при глубоких тромбоцитопениях и многих (но далеко не всех) дисфункциях тромбоцитов, особенно резко — при болезни Виллебранда. При гемофилиях время кровотечения нормальное или почти нормальное.
Подсчет тромбоцитов в периферической крови производится в камере Горяева при использовании в качестве разводящей и гемолизирующей жидкости 1 % раствора оксалата аммония. При подсчете пользуются микроскопом с фазовоконтрастной приставкой или с подкрашиванием (например, цитратнофурацилиновым раствором по И. И. Данилину, В. Л. Крыжановскому, 1967). Норма тромбоцитов 180—350·Ю^л. Возможно автоматизированный подсчет выполнять с помощью счетчиков частиц (целлоскоп и др.). Подсчет тромбоцитов важен для диагностики тромбоцитопений, тромбоцитопатий, сопровождающихся снижением числа тромбоцитов в крови (аномалии Мея—Хегглина, Бернара—Сулье и др.), а также заболеваний с интенсивным депонированием тромбоцитов в селезенке (гепатолиенальные синдромы, спленомегалии, синдром гиперспленизма), в гигантских ангиомах (синдром Казабаха — Мерритта), в микрососудах при их массивных дисплазиях, в очагах массивного тромбообразования и при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания. Особенно значительно снижение числа тромбоцитов Крови при множественном микротромбообразовании, связанном с интенсивной агрегацией тромбоцитов (например, при тромботической тромбоцитопенической пурпуре Мошковица).
Определение размера тромбоцитов осуществляется в окрашенном азуром II мазке с помощью окулярного микрометра. Тромбоциты человека по диаметру подразделяются на микроформы (менее 2 мкм),
Образование коротких отростков и выпуклостей в виде тутовых ягод (а, б), распластанных форм с длинными отростками (в), мешотчатых форм с древовидными отростками (г). На а, б, в видна дегрануляция — отделение плотных гранул. мезоформы (2—4 мкм), макроформы (4—б мкм) и мегалоформы (более 6 мкм). В норме микроформ 2—15%, мезоформ 82—89%, макроформ— 1—11%. При гиперрегенераторных тромбоцитопениях с укороченной продолжительностью жизни кровяных пластинок (иммунные тромбоцитопении, формы потребления) увеличивается число крупных, в том числе и беззернистых (голубых), пластинок. При разных тромбоцитопатиях могут преобладать либо микроформы (синдром Вискотта — Олдрича и др.), либо гигантские тромбоциты (аномалии Мея — Хегглина, Бернара — Сулье).
Эдектронн ом икроскопическое исследование тромбоцитов позволяет изучить их ультраструктуру. Особое значение имеет содержание гранул разной плотности, поскольку при большой группе тромбоцитопатий в кровяных пластинках мало плотных гранул (см. главу Тромбоцитопатии).
Сканирующая электронная микроскопия и применяемая в последнее время световая микроскопия с интерференционной оптикой по Номарскому (рис. 167) позволяют визуально оценивать изменения формы тромбоцитов, их способность распластываться и образовывать отростки, опреде
Исследование адгезивности (р етенции) тромбоцитов осуществляется путем "просасывания крови с определенной скоростью через поливиниловую трубку, заполненную стандартными стеклянными шариками диаметром 0,5 мм (метод Saizman, 1963), через косичку из стекловолокна (метод Т. А. Одесской и соавт., 1971) или, через трубки, заполненные коллагеном (метод Baumgartner, 1971). Об адгезивности (ретенции) судят по уменьшению числа тромбоцитов в крови до и после фильтрации. Исследование проводится в закрытой системе, так как соприкосновение крови с воздухом, особенно в условиях перемешивания, существенно искажает результаты.
Ближе к естественным условиям исследование ретенции тромбоцитов человека в отрезке сосуда (аорты кролика) с предварительно удаленным эндотелием [Baumgartner, Haudenschild, 1972; Turitto, Baumgartner 1976].
Показатели, соответствующие норме, свои в каждой лаборатории, поскольку результаты определения зависят от техники исследования. Нормальные показатели адгезивности тромбоцитов чаще составляют 20—50%. Диагностическое значение имеет резкое снижение (менее 10%) адгезивности, что связано либо с качественной неполноценностью тромбоцитов, либо с дефицитом в плазме фактора Виллебранда.
Исследование агрегационной функции тромбоцитов осуществляется: микроскопическими методиками — подсчетом и определением величины агрегатов в плазме, богатой тромбоцитами, после добавления стимуляторов агрегации, фотометрическими (принцип Born, 1962) с графической или потенциометрической регистрацией процесса и визуальными методами — путем регистрации момента начала агрегации и ее интенсивности. Исследования выполняют при постоянном помешивании и термостатировании. В качестве стимуляторов агрегации используют адреналин, АДФ в разных концентрациях, дающих двух и одноволновый подъем на агреграмме (рис. 168), коллаген или вытяжки из соединительной
ткани, тромбин, арахидоновую кислоту, тромбоксан, ристомицин (ристоцетин). Регистрацию ведут на фотоэлектроколориметрах с приспособленными термостатирующими камерами, мешалками и записывающими устройствами, на самодельных либо на выпускаемых промышленностью агрего метрах (отечественный аппарат БИАНАТ1, зарубежные Элви, Хронолог и др.).
Для выявления дисфункции тромбоцитов у детей раннего возраста Л. 3. Баркаган, Б. Ф. Архипов (1980) разработали оригинальную микрометодику, требующую всего 0,4 мл плазмы. В качестве стимулятора агрегации в этом тесте используется гемолизат собственных эритроцитов обследуемого (гемолизатагрегационный тест).
Развернутое исследование агрегационных функций тромбоцитов имеет первостепенное значение для диагностики тромбоцитопатий, оценки действия на тромбоцитарный гемостаз различных лекарственных средств, изучения сохранности тромбоцитов при плазма и цитаферезе, гемосорбции, использовании аппаратов искусственного кровообращения и гемодиализа и т. д. Существенное значение оно имеет и для распознавания тромбофйлических состояний.
Определение в плазме компонентов плотных гранул тромбоцитов — пластиночного фактора 4 (антигепаринового протеина), ртромбоглобулина и серотонина. Используется для оценки реакции освобождения (о которой судят и по наличию второй волны на агреграмме) и выявления внутрисосудистой активации тромбоцитарного гемостаза, при которой уровень указанных факторов в плазме существенно повышается. При тромбоцитопатиях, характеризующихся отсутствием в тромбоцитах плотных гранул, нарушением реакции освобождения или фиксации серотоннна, фактора 4 и (или) ртромбоглобулина, эти ингредиенты не выделяются в плазму в процессе агрегации. Серотонин в плазме и в тромбоцитах определяется спектрофлюорометрически [Соломонов А. П., Ларский Э. Г., 1973, и др.], ртромбоглобулин—иммунологически со специфической антисывороткой, фактор 4 тромбоцитов и его реакция освобождения в процессе агрегации — по ослаблению действия гепарина на тромбин [Лычев В. Г., 1974].
Фактор Виллебранда в плазме определяется по способности бестромбоцитарной плазмы обследуемого в смеси с раствором ристомицина или ристоцетина вызывать агглютинацию отмытых и фиксированных формалином нормальных тромбоцитов человека. Норма составляет 85— 115%. Снижение этого фактора свойственно болезни Виллебранда и вторичному синдрому Виллебранда, а повышение указывает на повреждение эндотелия. Такое повышение закономерно наблюдается при тромбоваскулитах, массивных тромбозах, синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания [Цигулева О. А,, 1978, 1982; Архипов А. Г., и Бишевский К. М., и др.].
Фактор Виллебранда можно определить и без ристомицина — иммунологически либо с агрегирующим агентом змеиного яда [Якунин Г. А. и др., 1982; Перегудова И. Г., 1983, Brinkhous et al., 1977].
Исследование спонтанной агрегации тромбоцитов в кровотоке проводится с помощью сканирующей электронной микроскопии (оптика Номарского) или по убыли из крови тромбоцитов после осаждения агрггатов (метод Wu, Hoak, 1974). В первом случае определяются число активированных тромбоцитов (с выбуханиями и отростками) и число агрегатов, во втором — разница между числом тромбоцитов в плазме после 30минутного отстаивания (для оседания агрегатов) крови, стабилизированной ЭДТА и ЭДТАформалиновым раствором. В норме в агрегаты включается не более 10—15% тромбоцитов. . При наклонности к тромбозам, тромбоэмболиях и синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания эти показатели нередко нарастают.
По методу Н. И. Тарасовой (1979) определяют процент включения тромбоцитов в агрегаты в процессе механического перемешивания богатой тромбоцитами плазмы (норма—до 10%).
Фактор 3 тромбоцитов определяется либо по разнице показателей каолинового времени свертывания рекальцифицированной плазмы до и после удаления из нее тромбоцитов (методы Rabiner, Hrodek, 1968, и др.), либо по разнице времени свертывания плазмы, богатой и бедной тромбоцитами, под влиянием яда гадюки Рассела (метод Spaet, Cintron, 1965) или гюрзы (метод 3. С. Баркагана и соавт., 1973, 1975). Выполняя эти тесты до и после агрегации тромбоцитов (под влиянием АДФ или других агентов) можно получить представление о процессе высвобождения фактора 3 из кровяных пластинок. Среднее нормальное содержание в плазме фактора 3 принимается за 100%, в бестромбоцитарной плазме — за 0%. По кривой разведения определяют активность фактора 3 в плазме обследуемого до и после агрегации.
Метод освещает одну из основную сторон участия тромбоцитов в свертывании крови. При ряде тромбоцитопатий резко нарушается активность фактора 3 или его освобождение в процессе агрегации [Owen, Bowie, 1971, 1978]. При массивных тромбозах и синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания содержание фактора 3 в плазме повышается, что свидетельствует о внутрисосудистой активации тромбоцитов.
Ретракция к ровяного с г у с т к а — общеизвестный тест, характеризующий способность тромбоцитов стягивать волокна фибрина в сгустке, в результатеччего объем сгустка уменьшается и из него отжимается сыворотка (в норме около 75—80% при ретракции кровяного сгустка и более 92 % при ретракции плазменного сгустка). При исследовании цельной крови на показатели ретракции влияют гематокрит и содержание эритроцитов: при анемии выделяется больше сыворотки, при полиглобулиях — меньше. Однако ретракция наиболее зависит от количества тромбоцитов и их функционального состояния, а также от количества фибриногена. При глубокой тромбоцитопении сгустки не подвергаются ретракции, она нарушена и при ряде тромбоцитопатий (тромбастения Гланцмана, тяжелая уремическая тромбоцитопатия и др.), снижена при значительной гиперфибриногенемии.
С помощью механотрона можно измерить силу ретракции [Шитикова А. С. и др., 1975].
Продолжительность, жизни тромбоцитов в циркуляции наиболее точно определяется с помощью радиоактивной метки (чаще всего ^Сг). В норме полупериод нахождений этих клеток в кровяном русле составляет 4—5 дней. При тромбоцитопениях, обусловленных действием антитромбоцитарных антител, интенсивной убылью кровяных пластинок в тромбы и ангиомы, депонированием и мацерацией этих клеток в селезенке и печени, это время укорачивается (в тяжелых случаях до нескольких часов).
Определение антитромбоцитарных антител имеет значение для разграничения иммунных и неиммунных тромбоцитопении. Наиболее надежен, хотя и трудно выполним, тест Диксона и соавт. (1975), в кооором определяется нагруженность тромбоцитов иммуноглобулинами класса G. По данным В. Г. Савченко и Л. И. Идельсона (1980), на нормальном тромбоците содержится в среднем 14·Ю^ г этих иммуноглобулинов, а у больных иммунными тромбоцитопениями — 20—250·Ю^ г. При очень низком содержании тромбоцитов в крови метод Диксона неприменим.
Тесты, выявляющие готовность тромбоцитов к формированию тромбов. В последние годы разрабатываются новые методы, определяющие повышенную готовность тромбоцитов к инкорпорации в фибриновые сгустки, перестройку мембран и контрактильной системы этих клеток, изменение их чувствительности к плазменным стимуляторам и ингибиторам агрегации [Перегудова И. Г., 1978, 1980, и др.]. К этой же группе можно отнести методы определения антиагрегационной активности сосудистой стенки [Балуда В. П. и др., 1980, 1982; Лакин К. М. и др., 1981 и др.]. Все эти методы важны для выявления тромбогенных сдвигов в системе гемостаза, но для использования в клинике нуждаются в дальеейшем изучении и стандартизации.